携带lipocalin 2基因的溶瘤腺病毒对胰腺癌细胞生长的体外抑制作用

　　（论文）携带lipocalin 2基因的溶瘤腺病毒对胰腺癌细胞生长的体外抑制作用

　　携带lipocalin 2基因的溶瘤腺病毒对胰腺癌细胞生长的体外抑制作用

　　携带lipocalin 2基因的溶瘤腺病毒对胰腺癌细胞生长的体外抑制作用

　　携带lipocalin 2基因的溶瘤腺病毒对胰腺癌细胞生长的体外抑制作用

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　　内容提示：# 实验研究#携带 Lipocalin2 基因的腺病毒对结肠癌细胞 SW620 的体外抑制作用张云龙, 彭 彦 , 姚 立( 浙江中医药大学药学院药理教研室 杭州 310053)摘要: 目 的 探讨携带 Lipocalin2基因的腺病毒对结肠癌 SW620 细胞的增殖抑制 效果和诱导凋 亡的作用 。 方法 以 不同 浓度梯度的腺 病毒作用 于体外培养的结肠癌 SW620 细胞, 通过 MTT 法检测腺病毒对细胞生长的抑制作用 , 倒置显微镜下 观察细胞的形态 变化, 透射电镜观察细胞凋亡时的超微形态变化, 流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果 MTT 实验显示携带 Lipocalin2 基因 的腺病毒可抑制 SW620 ...

　　# 实验研究#携带 Lipocalin2 基因的腺病毒对结肠癌细胞 SW620 的体外抑制作用张云龙, 彭 彦 , 姚 立( 浙江中医药大学药学院药理教研室 杭州 310053)摘要: 目 的 探讨携带 Lipocalin2基因的腺病毒对结肠癌 SW620 细胞的增殖抑制 效果和诱导凋 亡的作用 。 方法 以 不同 浓度梯度的腺 病毒作用 于体外培养的结肠癌 SW620 细胞, 通过 MTT 法检测腺病毒对细胞生长的抑制作用 , 倒置显微镜下 观察细胞的形态 变化, 透射电镜观察细胞凋亡时的超微形态变化, 流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果 MTT 实验显示携带 Lipocalin2 基因 的腺病毒可抑制 SW620 细胞的 生长, 显微镜下可观察到细胞肿胀、破裂、呈坏死状, 透射电镜下观察发现细胞体积 缩小, 细胞核固缩, 核内 染色质凝集, 并附于一侧核膜 的边缘, 内 质网扩张, 空泡形成增多, 出 现明显的凋 亡现象。 流式细胞仪可检测到 SW620 细胞凋亡率明显增加, 呈时间 及浓度依赖性。 结 论 携带 Lipocalin2基因的腺病毒能通过诱导细胞凋亡的方式有效地抑制 SW620 细胞的生长。关键词: 腺病毒; 结肠癌细胞 SW620; 流式细胞仪; 细胞凋亡; 透射电镜中图分类号: R969 文献标识码: A 文章编号: 1006 -3765( 2013)-01-0268 -03作者简介: 张云龙, 男( 19881 2- ) 。 浙江中医药大学药理学硕 士研究生。 联系电话: , E - mail: zhangyunlong8822@ sina1 com通讯作者: 姚立, 男( 1969- ) 。 浙江中医 药大学药 学院硕 士生 导师。联系电话: , E - mail: ylyj@ mail1 hz1 zj1 cn基金项目 : 国家自 然科学基金( 编号: 81173640) 细胞凋 亡作为生物细 胞对内外 信号刺 激的一种反应, 在正常细胞的 发育过程中调 控细胞的 死亡过程, 凋亡的 产生可能由不同生理、生化 或有毒物质诱发112。 结肠癌是常 见恶性肿瘤, 我国是结肠癌的高发国家。 随着经济发展, 生活方式的改变, 结肠癌的 发病日 渐增 多12, 32。 目 前溶瘤病毒 在癌 症治疗中备受关注, 溶瘤病毒能通过感染临 近肿瘤细胞而导致肿瘤细胞裂解。 部分不携带外源治疗基因的溶瘤病毒已在肿瘤治疗的临床试验中显示出了 有效性和可行性142。 基因治疗是目前国内外 研究的热点之一, 近年来作为基础的病毒 载体的研究有了 突飞 猛进的进展。 腺病 毒载体转导目 的基因 高效率、低致病性、 高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点, 已被认为是最为有效的转基因载体之一, 并广泛运用于人类基因治 疗。 若在 溶瘤病 毒载体的基础上携带 治疗基因,则治疗基因的表达量可比传统腺病毒载体高数百倍152。 这种携带治疗基因的溶瘤病毒具有病毒和治疗基因的协同抗肿瘤作用162, 理想的治疗基因应能诱导肿瘤细胞凋亡, lipocalin2 是lipocalin 家族的成员, 是一种脂质转运蛋白, 其功能复杂, 现已有报道 lipocalin2 具有 促进肿 瘤细 胞 凋 亡172和 抗 肿 瘤转移18, 92。 作用本文通过研究携 带 Lipocalin2 基因的 腺病 毒对结肠癌 SW620 细胞生长的抑制以及诱导细胞凋亡的作用, 旨在探讨腺病 毒体外对肝癌 的作用效果, 为其进一步应用提供有力的实验依据。1 材料11 1 病毒及 细胞 携 带 Lipocalin2 基因的 腺病 毒由 上海复旦大学提供。 结肠癌 SW620 细胞由浙江省医学科学院提供。11 2 试剂 RPMI-1640 干粉( 美国 Gibco 公司 产品) ; 胎牛血清(杭州四季青公司) ; 胰蛋白 酶(美 国 Gibco 公司产 品) ; 四甲基偶氮唑盐( MTT, sigma 公 司) ; 二 甲基亚砜( 江苏强 盛化 工有限公司) ; 注射用生理盐水( 杭 州名 生药业有限公 司) ; An -nexinV -PI 细胞凋亡检测试剂盒( 南京碧波生物) 。11 3 仪器 ALE -200 型电 子 分析天平( 湘 仪天平仪器厂) ;YXJ -1 型离心机( SIGMA) ; CO2 培养箱(HERAEUS) ; 酶标仪(MAGELLAN) ; CKX41 型倒 置显微镜( OLYMPUS) ; 流式 细胞仪( FACS cadibur) ; 透射电镜( 日 本, HitachiH -7650 型) ; 超薄切片机( Reichert) 。2 方法21 1 结肠癌 SW620 细 胞培养 结 肠癌细 胞 SW620 常规 培养于含 10% 热灭活的胎 牛 血清、 100u# mL- 1青霉索、 100u#mL- 1链霉索 的 RPMI -1640 培养液中, 37e、 5% CO2 及饱 和湿度条件下培养, 取对数生长期细胞进行各项实验。21 2 MTT 法检测 携 带 Lipocalin2 基因 的腺病 毒 对结 肠癌SW620 细胞增 殖的 影 响 取 对数生长期 的 SW620 细 胞 消化, 配制成 1@ 105个/ mL 细胞悬液, 接种 于 96 孔培养板中,每板 200LL。 设 7 个浓度的 药物组, 空 白对照组, 每组 12 复孔。 药物组加不同浓度 的携带 Lipocalin2 基因的 腺病毒 使其终浓度分别为 20、 15、 10、5、 3、 1、 01 5 MOI。 空 白对照组为 不加药物的培养基。 置 37 e, 5% CO2 培养箱中分别培养 48、72h 后每孔加 MTT 20LL, 继续培养 4h 后取出, 吸弃培养基,每孔加 150LL DMSO, 于酶标仪 490nm 处测定其 OD 值, 以正常组 OD 值为对照, 计算各孔细胞抑制率(% ) = (1- 各孔 OD值/ 正常组 OD 值均数) @ 100。21 3 透射电 镜观 察携 带 Lipocalin2 基因 的腺病毒对 SW620超微结构的影响 将细胞接种于六孔 板, 给予低 浓度的 携带Lipocalin2 基因的腺病毒分别处理 48h、 72h 后, 收集各组细胞于 EP 管中, 于21 5% 的戊二醛溶液中固定, 置于4 e冰箱中过夜, 然后按下列步骤处理: 倒掉固 定液, 用 01 1M, pH 71 0 的磷酸缓冲液( PBS) 漂洗细 胞 3 次, 每次 15min; 1% 的锇酸溶液固定 1~ 2h 后, 重复上述操作, 梯度 浓度乙 醇溶液进行脱水处理, 每种 浓度 处理 15min, 再用 100% 的乙 醇处理 1 次, 每次20min; 最后过度到 纯丙酮 处理 20min; 分别 用包 埋剂 与丙 酮#268#海峡药学 2013 年 第 25 卷 第 1 期

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